Dai nematodi agli esseri umani, la segnalazione attraverso la famiglia dei recettori proteici Notch guida lo sviluppo embrionale, la differenziazione cellulare e l’omeostasi dei tessuti. È anche assolutamente essenziale per la trasformazione delle cellule immunitarie umane immature in cellule T, guerrieri cellulari che prendono di mira virus e tumori.
Tuttavia, l’attivazione della segnalazione Notch è stata difficile da imitare in laboratorio, rendendola quasi impossibile da sfruttare in clinica e ostacolando gli sforzi per generare terapie con cellule T. Ma le cose potrebbero cambiare.
A luglio, ai partecipanti a una conferenza a Lewiston, nel Maine, dedicata alla segnalazione di Notch, è stato presentato non uno, ma due nuovi strumenti per attivare il percorso. Due gruppi di ricerca hanno lavorato in parallelo per sviluppare ciò che hanno presentato alla conferenza.
“È stato un punto di svolta”, afferma Juan Carlos Zúñiga-Pflücker, immunologo dello sviluppo presso l’Università di Toronto in Canada, il cui laboratorio ha aperto la strada a molte tecniche di attivazione di Notch. Per lui gli annunci rappresentavano una “sorta di riemersione” di questo lavoro nel campo di Notch.
Problemi con il 2D
La maggior parte dei recettori subisce qualche tipo di cambiamento conformazionale dopo essersi legati ai propri ligandi, portando a una catena di eventi che altera il comportamento della cellula. Ma il solo legame con il ligando non è sufficiente per attivare Notch.
Una volta che il recettore si lega al suo ligando (che è legato a un’altra cellula), la cellula che esprime il ligando si avvolge nel complesso ligando-recettore. Come tirare un filo allentato in un maglione, la forza di trazione risultante dipana parte del recettore Notch, esponendolo agli enzimi che rilasciano il dominio intracellulare del recettore e gli permettono di viaggiare verso il nucleo per influenzare l’espressione genetica.
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“La vera sfida tecnologica è trovare un farmaco in grado di imitare questo effetto di attrazione”, afferma Vincent Luca, un ingegnere proteico presso il Moffitt Cancer Center di Tampa, in Florida.
Le strategie attuali richiedono la co-coltura di cellule che esprimono il recettore Notch con cellule che esprimono il ligando, o il fissaggio del ligando su piastre o sfere. Ma questi metodi ‘2D’ non possono essere utilizzati in vivodice Luca.
Costituiscono anche un collo di bottiglia per la produzione su larga scala di cellule T, afferma George Daley, ematologo e biologo specializzato in cellule staminali presso la Harvard Medical School di Boston, Massachusetts, perché solo le cellule all’interfaccia che presenta il ligando possono essere attivate. Per anni, il laboratorio di Daley ha lottato con i limiti dei metodi 2D nel tentativo di trasformare le cellule staminali pluripotenti in cellule T.
Nel 2021, Daley è stato avvicinato da Rubul Mout, allora ricercatore post-dottorato presso l’Università di Washington a Seattle nel laboratorio di David Baker, che ha vinto una parte del Premio Nobel per la chimica 2024 per il suo lavoro nella progettazione di proteine assistita da computer. Mout voleva applicare quelle tecniche di progettazione ai sistemi basati sulle cellule staminali di Daley.
Daley era “tremendamente entusiasta” all’idea, e prima ancora che Mout entrasse ufficialmente nel suo laboratorio, discussero di progettare un agonista Notch solubile, uno che potesse presentare un ligando Notch alle cellule in sospensione anziché su una superficie piana.
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Utilizzando lo strumento di progettazione delle proteine Rosetta sviluppato nel laboratorio di Baker, Daley, Mout e i loro colleghi hanno progettato potenziali agonisti attaccando più copie del ligando a un’impalcatura proteica. Hanno sperimentato progetti con un minimo di due e un massimo di 120 copie del ligando, nonché con geometrie diverse.
Una disposizione ha funzionato particolarmente bene: tre copie del ligando che si irradiano dall’impalcatura, come raggi. Quando aggiunto alle cellule che esprimono Notch in sospensione, questo ligando multivalente collegava insieme le cellule in modo microscopico passo a duecon ciascuna cellula T in via di sviluppo che tira delicatamente (e attiva) l’altra. Rispetto all’attivazione 2D, l’attivazione di Notch utilizzando l’agonista solubile in un bioreattore ha creato cinque volte più cellule T per microgrammo di agonista1suggerendo che questo approccio potrebbe essere utile per la produzione di cellule T su larga scala.
Notch potenziante
Luca dice che il suo gruppo, al contrario, stava cercando un “modo mirato e mirato per attivare Notch”, con un occhio alla terapia. Ad esempio, il potenziamento di Notch potrebbe ringiovanire le cellule T esaurite che cercano di distruggere un tumore, ma ciò deve essere fatto senza attivare le cellule tumorali, che esprimono anche Notch.
Il laboratorio di Luca ha generato SNAG, agonisti sintetici di Notch (vedi ‘Imitare notch’), fondendo un gene per un agonista di Notch con uno che codifica per un frammento di anticorpo che prende di mira le cellule tumorali. Il risultato codifica per una proteina bispecifica che forma quello che Luca chiama un “piccolo ponte molecolare” tra una cellula che esprime Notch e la cellula che esprime l’antigene del cancro. Questo evento di legame attiva meccanicamente il recettore in modo simile alla segnalazione naturale di Notch2.
Fonte: adattato dal rif. 2
A gennaio è stato presentato un agonista Notch solubile molto diverso. Il biofisico Björn Högberg e il suo team del Karolinska Institute di Stoccolma studiano le minuscole interazioni tattili tra le proteine durante la segnalazione cellulare, che Högberg paragona a “un sistema Braille” che le cellule usano per comunicare tra loro.
Lavorando con Luca, il team ha creato un agonista ibrido DNA-proteina attaccando più copie del ligando Notch lungo un pezzo di DNA che era stato piegato, in stile origami, in un bastoncino. Con loro sorpresa, l’agonista ha attivato Notch senza generare alcuna forza di trazione misurabile3.
I ricercatori suggeriscono che il loro agonista origami potrebbe innescare un meccanismo alternativo di attivazione, in cui il legame a lungo termine del ligando è sufficiente a causare il disfacimento del recettore, anche se a un ritmo molto più lento. Ma stanno ancora cercando di capire come potrebbe funzionare.
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Le reazioni della comunità sulla possibilità di un meccanismo di attivazione Notch indipendente dalla trazione sono state contrastanti, afferma Högberg: “Penso che alcuni di loro fossero davvero incuriositi e volessero davvero saperne di più, e alcuni di loro erano come, ‘Non lo so’. ‘non penso che questo sia niente.'”
Da parte sua Zúñiga-Pflücker è scettico sul fatto che il legante dell’origami funzioni senza alcuna forza di trazione. Ma “il lavoro è davvero ben fatto”, dice, aggiungendo che “tutti e tre gli articoli sono piuttosto interessanti in modi diversi”.
Anche solo pochi anni fa, dice Mout, de novo la progettazione delle proteine non era sufficientemente avanzata per affrontare una biologia significativa. Ma il campo è in rapida evoluzione, dice, e i problemi reali vengono risolti. “Ora tutto sta andando bene”, dice.
