Soggetti umani
Lo Stanford Institutional Review Board ha approvato questo studio, che è stato registrato su ClinicalTrials.gov (NCT04196413). Sono stati ottenuti il consenso informato del paziente o dei genitori e il consenso del bambino. Nel consenso è incluso il permesso di condividere i risultati (non identificati) della sperimentazione in pubblicazioni o presentazioni scientifiche. È stata inoltre ottenuta l’autorizzazione alla pubblicazione di immagini, fotografie e video.
Valutazione della risposta
La risposta clinica è stata valutata utilizzando il CIS3 generato da esami neurologici basati su protocollo eseguiti da un neuro-oncologo ai tempi prescritti dopo la somministrazione di cellule T GD2-CAR. Il CIS rappresenta una semplice quantificazione dell’esame neurologico, che aggiunge o sottrae un punto per ciascun sintomo/segno che è migliorato o peggiorato, rispettivamente, dall’esame basale preinfusione del paziente (Metodi Supplementari 5). Per i pazienti che hanno ricevuto una terapia con corticosteroidi per la gestione della tossicità, il punteggio CIS è stato rinviato fino ad almeno 7 giorni dopo la sospensione del corticosteroide. Le risposte all’imaging sono state valutate mediante scansioni MRI del cervello e/o del midollo spinale con e senza gadolinio. Poiché i DMG sono diffusamente infiltrativi delle strutture del sistema nervoso centrale e difficili da misurare in dimensioni lineari, un neuroradiologo ha eseguito la segmentazione volumetrica del tumore corrispondente al segnale T2 anomalo per misurare il cambiamento radiografico del volume del tumore, in linea con le raccomandazioni RANO 2.041.
Analisi statistica
La stima della dimensione del campione si è basata su considerazioni cliniche e sul disegno di Fase I 3 + 3. Il tasso di DLT target era pari o inferiore al 30%. Sono stati inclusi nell’analisi tutti i pazienti arruolati nel braccio A e che hanno ricevuto un’infusione di cellule T GD2-CAR nello studio. Sono state utilizzate statistiche descrittive per riassumere le caratteristiche basali del paziente e della malattia, i dati sulla tossicità e gli esiti correlati e clinici. Il test di normalità di Shapiro-Wilk è stato utilizzato per valutare la distribuzione normale (gaussiana) dei dati di risposta volumetrica del tumore. La sopravvivenza globale è stata misurata dalla data della diagnosi alla data in cui si è verificato l’evento o censurata al momento del cut-off dei dati. La probabilità di sopravvivenza è stata stimata utilizzando il metodo Kaplan-Meier42. L’intervallo di confidenza del tempo di sopravvivenza mediano è stato costruito con il metodo di Brookmeyer-Crowley43. Tutti i confronti effettuati nei risultati correlati erano esplorativi. Mann-Whitney UÈ stato utilizzato il test, senza apportare modifiche per confronti multipli. Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software Prism.
Studi correlativi
Campioni di sangue periferico e liquido cerebrospinale sono stati raccolti prima e dopo le infusioni IV e ICV per misurare i livelli di citochine/chemochine nel sangue e nel liquido cerebrospinale, la persistenza di GD2-CART mediante qPCR e CAR-FACS e il DNA tumorale libero da cellule nel liquido cerebrospinale, come dettagliato nel rapporto precedente dei primi quattro pazienti3 e ribadito infra.
Misurazione qPCR dell’espansione GD2-CAR in vivo
I campioni di sangue dei pazienti sono stati trattati e le cellule mononucleate sono state crioconservate in modo vitale. Il DNA è stato estratto dal sangue intero (2 × 106–5×106 cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC)) utilizzando il kit QIAmp DNA blood Mini (Qiagen, n. di catalogo 51306) al basale e in più punti temporali successivi alla somministrazione di CAR. La presenza di CAR è stata misurata mediante qPCR utilizzando le sequenze di primer e sonda fornite di seguito. Per la curva standard, è stato progettato un plasmide Minigene (IDT) personalizzato contenente una sequenza parziale GD2.41BB.z e una sequenza parziale di albumina, che fungeva da controllo per la normalizzazione. La curva standard conteneva una diluizione seriale dieci volte del plasmide compresa tra 5 × 108 e 5×100 copie. Sia il plasmide che il DNA del paziente da ciascun punto temporale sono stati analizzati in triplicato, con ciascuna reazione contenente 5 µl di DNA (50 ng in totale), primer di albumina forward e reverse da 200 nM (o primer GD2.41BB.z forward e reverse da 300 nM), Sonda da 150 nM sospesa in 10 µl di TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), senza AmpErase UNG (Thermo Fisher Scientific) e 24,5 µl (albumina) o 22,5 µl (GD2.41BB.z) di tampone TE (Invitrogen, n. catalogo AM9935). Per la qPCR è stato utilizzato lo strumento Thermo Fisher Scientific QuantStudio 6 Pro Real-time qPCR, con 20 µl per reazione. Le metriche di qualità per tutti i risultati della curva standard qPCR erano R2> 0,95 ed efficienza 70–110%.
I risultati dell’albumina dalla piastra sono stati normalizzati all’albumina media, quindi il numero di copie GD2-CAR (copie per 50 ng di DNA), adattato all’albumina e modificato in copie per 100 ng di DNA, è stato calcolato mediante la seguente equazione: numero di copie (copie per 100 ng di DNA) = 2 × (numero di copie GD2-CAR × (numero di copie di albumina/albumina media)).
Saggio di citometria a flusso in tempo reale
È stato progettato un pannello di citometria a flusso ad alta dimensione, con immunofenotipizzazione, per la profilazione immunitaria delle cellule T CAR in tempo reale. Le PBMC sono state isolate dal sangue intero fresco mediante centrifugazione in gradiente su ficoll (Ficoll paque Plus, GE Healthcare, Sigma-Aldrich). Tra 2 milioni e 5 milioni di PBMC sono stati colorati con la colorazione fissabile di vitalità reattiva all’ammina Live/Dead acqua (Invitrogen). Le cellule sono state preincubate con blocco Fc (trusin, BioLegend) per 5 minuti, quindi colorate a temperatura ambiente con mAb coniugato con fluorocromo in una combinazione di colorazione a 15 colori e 17 parametri come descritto in precedenza3 . I coniugati anticorpo-fluorocromo utilizzati erano: anti-CD3-FITC (BioLegend, 0,5 µg di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); anti-CD8-PerCP Cy5.5 (BD Biosciences, 0,5 µg di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); anti-CD45-BV785 (BioLegend, 1 µg di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); anto-CD4-BV711 (BioLegend, 1 µg di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); anti-CD95-BV650 (BioLegend, 0,5 µg di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); CD39-BV605 (BioLegend, 1 µg di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); anti-CD57-BV421 (BioLegend, 1 µg di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); anti-CCR7-BUV805 (BioLegend, 1 µg di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); anti-CD45RA-Alx700 (BioLegend, 0,5 µg di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); anti-GD2-CAR-DyLight650 (personalizzato, clone 1A7, 1 µg di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); anti-CD14-PE-Cy7 (BioLegend, 1 µg di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); anti-CD11b-APC-Cy7 (BioLegend, 1 µg di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); anti-CD33-PE-Dazzle (BioLegend, 5 µl di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl); e anti-GD2-PE (BioLegend, 5 µl di anticorpo per 1 milione di cellule in 100 µl). Per determinare la concentrazione ottimale di anticorpi per la colorazione nel pannello CAR-FACS, ciascun anticorpo coniugato con fluorocromo è stato titolato per determinare la quantità saturante di anticorpo necessaria per colorare un test su 1 milione di cellule. Le curve dose-risposta per ciascun anticorpo informavano sulla quantità di saturazione dell’anticorpo coniugato con fluorocromo necessaria per colorare 1 milione di cellule in 100 ml di volume di colorazione.
Le cellule T trasdotte con CAR sono state utilizzate come controllo positivo incluso negli esperimenti di colorazione quotidiana. Le cellule immunocolorate e fissate sono state acquisite su un analizzatore a cinque laser LSR (BD BioSciences) (blu, 488 nm; viola, 405 nm; ultravioletto, 355 nm; rosso, 640 nm; verde, 532 nm). Un minimo di 106sono state acquisite cellule, a meno che non siano limitate dal numero di cellule isolate da 8 ml di sangue intero o durante l’acquisizione di cellule isolate dal liquido cerebrospinale. Il limite di rilevamento del test per le cellule è stato calcolato come 1 su 104del totale delle PBMC acquisite. Il gating rappresentativo è mostrato nei dati estesi Fig. 10.
Citochine Luminex
I campioni di sangue e liquido cerebrospinale dei pazienti sono stati raccolti in momenti predeterminati e di attivazione durante il trattamento. I campioni sono stati centrifugati a 250G per 6 minuti Il surnatante è stato congelato a -80 °C fino al dosaggio per la valutazione. La valutazione delle citochine è stata eseguita con l’Immunoassay Team-Human Immune Monitoring Center presso l’Università di Stanford. I pannelli includono Luminex–EMD Millipore HIMC H80 (il pannello 1 è Milliplex HCYTA-60K-PX48; il pannello 2 è Milliplex HCP2MAG-62K-PX23; il pannello 3 include Milliplex HSP1MAG-63K-06 e HADCYMAG-61K-03 (resistina, leptina ed epatociti fattore di crescita) per generare un nove-plex) e TGF-b (TGFBMAG-64K-03). I kit sono stati acquistati da EMD Millipore e utilizzati secondo le raccomandazioni del produttore, con le modifiche descritte. La configurazione del test ha seguito il protocollo raccomandato. In breve, i campioni sono stati diluiti tre volte per i pannelli 1 e 2 e dieci volte per il pannello 3. Il campione diluito (25 µl) è stato miscelato con sfere magnetiche legate con anticorpi in una piastra a 96 pozzetti e incubato per una notte a 4 °C con agitazione. Sia la fase di incubazione a freddo che quella a temperatura ambiente sono state eseguite su un agitatore orbitale a 500-600 giri al minuto. Le piastre sono state lavate due volte con tampone di lavaggio in una lavatrice Biotek ELx405 (BioTek Instruments). Dopo l’incubazione per 1 ora a temperatura ambiente con anticorpo di rilevamento biotinilato, è stata aggiunta streptavidina-PE per 30 minuti agitando. Le piastre sono state lavate come descritto sopra e PBS è stato aggiunto ai pozzetti per la lettura nello strumento Luminex FlexMap3D con un limite inferiore di 50 microsfere per campione per citochina. Le sfere di controllo Custom Assay Chex (Radix Biosolutions) sono state acquistate e aggiunte a tutti i pozzetti. I pozzetti con un numero di sfere inferiore a 50 sono stati contrassegnati e i dati con un numero di sfere inferiore a 20 sono stati esclusi. I dati sono presentati come picogrammi per millilitro, sulla base di curve standard o mappe di calore del cambiamento di piega rispetto al punto temporale di riferimento. Tutti i campioni sono stati analizzati in duplicato tecnico.
Riepilogo della rendicontazione
Ulteriori informazioni sul disegno della ricerca sono disponibili nel Nature Portfolio Reporting Summary collegato a questo articolo.
